Wat is Divergente Evolutie
Geef een voorbeeld. 

Twee genen die voor verschillende eiwitten maar hebben een gemeenschappelijke voorganger. Dat is vaak aan het aminozuurvolgorde te herkennen: de eiwitten hebben vaak veel overeenkomsten in de primaire structuur.

Voorbeeld:

Actine en HSP-70**

** HeatShock Protein-70 

Wat is Convergente Evolutie
 Geef een voorbeeld

Twee eiwitten die een soortgelijke structuur hebben maar niet veel overkomsten kwa aminozuurvolgoirde zijn vaak een teken van convergente evolutie. Deze eiwitten voeren vaak soortgelijke taken en hebben verschillende voorgangers.

voorbeeld:
Chemotrypsin en Subtilisin 

Eigenschappen van Eukaryoten

1) Groter dan Prokaryoten

2) Leven in zuurstof rijke omgevingen

3) Cyclisch DNA

4) Cyclisch DNA (bij Bacterië)

5) Meerdere compartimenten in de cel

1) Kleiner dan Eukaryoten (1 micrometer breed)

2) Leven ook in zuurstof-arm omgevingen

3) los DNA (geen chromosoom)

4) 1 compartiment

Wat is het Hydrofobe effect?

Niet-geladen moleculen hebben de neiging om in water met elkaar to reageeren of bij elkaar te komen. Dit is de drijvende kracht van veel reacties, bijvoorbeeld eiwitvouwing.

Aminozuren

Alle aminozuren die eiwitten vormen zijn L isomeren, en bijna allemaal hebben ook een S absolute configuratie.

Bij netrale PH in oplossing zijn AZ voornamelijkk te vinden in de vorm van dipolaire ionen (Zwitterionen)

Glycine

De eenvouwdigste AZ, R=H.
Apolair.

Afkortingen: Gly, G 

[image]

Alanine

Alanine heeft een Me groep als zijketen,

Apolair.

Afkortingen: Ala, A

[image] 

Valine

R --> CH(CH3)2

Apolair.

[image]

Leucine

R--> CH2CH(CH3)2

Apolair;

Afkortingen: Leu, L

[image]

Isoleucine

R--> CH-CH3-CH2CH3

Apolair

Afkortingen: Ile, I

[image]

Methionine

R--> CH2CH2SCH3

Apolair;

Afkortingen: Met, M

[image]

Proline

R--> (CH2) zijketen verbonden aan beide de N als de α-C 

Apolair Cyclisch

Afkortingen: Pro, P

Proline is het minst flexible van de AZ, en heeft dus een groot effect op eiwitstructuur. Vormt soms (1:4) een Cis binding vanwege sterische hinder

[image]

Phenylalanine

R--> CH2-C6H5 - C-Benzeenring

Aromatische zijgroep, Heel Hydrofoob

Afkortingen: Phe, F

[image]

Tyrosine

R--> CH2-C6H4-OH

Aromatisch, enigszins Hydrofoob

Afkortingen: Tyr, Y

[image]

Tryptophan

R--> CH2-indole

Aromatisch, enigszins Hydrofoob

Afkortingen: Trp,W

[image]

Serine

R--> CH2-OH

Polair, alcohol

Hydrofiel en reactiever dan alanine en valine

Afkortingen: Ser, S

[image]

Threonine

R--> CHCH3OH

Polair, Alcohol

Hydrofiel en reactiever dan alanine en valine

Afkortingen: Thr, T

[image]

Asparagine

R--> CH2CONH2

Zuur, Amide

Afkortingen: Asn, N
Derivaat van Aspartate 

[image]

Glutamine

R--> CH2CH2CONH2

Zuur, Amide

Afkortingen: Gln, Q
Derivaat van Glutamate

[image]

Cysteine

R--> CH2SH

Bevat Thiol (Sulfhydryl), en kan sneller reageeren dan alcohol en ook disulfiedebruggen maken.

Afkortingen: Cys, C

[image]

Lysine

R--> CH2CH2CH2CH2NH3⁺

Basisch, positief geladen bij neutrale PH

Afkortingen: Lys, K

[image]

Arginine

R--> CH2CH2NH=C=(NH2)₂⁺

Basisch, positief geladen bij neutrale PH

Afkortingen: Arg, R

[image]

Histidine

R--> CH2-C2N2H3 Amidozole groep (Aromatisch)

Basische, ongeladen/positief geladen bij neutrale PH

Komt vaak voor in actieve sites van enzymen omdat amidozole kan makkelijk een proton binden / ontbinden

Afkortingen: His, H

[image]

Aspartate

R--> CH2CO=O^-

Zuur, amide, vaak negatief geladen bij net. PH

Bij sommige eiwitten kan toch een protoc accepteren (actief)

Afkortingen: Asp, D

[image]

Glutamate

R--> CH2CH2CO=O^-

Zuur, amide, vaak negatief geladen bij net. PH

Bij sommige eiwitten kan toch een protoc accepteren (actief)

Afkortingen: Glu, E

[image]

Alpha Helix

• Rechtshandig
• Elke AZ is verbnden via H-bruggen met een AZ 4 residues verder

β-sheet

• Twee strands of meerdere (soms meer dan 10, vaker 4-5)
• Parallel of antiparallel (vaker)

 [image]

β-Turn

• Minimaal 4 Az
• Niet regelmatig
• vaak te vinden aan et oppervlak van eiwitten (reactie)

α-Keratin

• Belangrijkste ingredient van haar, nagels en hoorn 
• Twee rechthandige α-helices vormen samen een Coiled Coil

Coiled Coil

• Twee or meer α-helices vormen een zeer stabiele structuur die tot 100nm lang kan groeien of meer
• Rechthandige α-helices vormen een linkshandige structuur
• 60 soortgelijke eiwitten bij de mens oa:
  - intermediaire filamenten
• - Myosine
  - Tropomyosine 
• Drijvende kracht is hydrofoob effect, door een repetitie van 7 AZ.
• De α-helices zijn verbonden door van der waals krachten en ionische interacties, en zijn uitgerekt.
• soms zijn de α-helices verbonden ook met disulfide bindingen door Cysyteine residues

Collagen

• Meest voorkomend eiwit bij zoogdieren
• De voornaamste component van huid, bot, tanden enz.
• Drie helices vormen een staafje, elk is ongeveer 100 residuen lang, elk derde residue is een glycine en Gly-Pro-Hydroxyproline sequenties komen vaak voor
• er zijn geen H-bruggen, maar de staven worden gestabililseerd door sterische afstoting van de proline en Hydroxyproiline residues.
• De drie helices zijn verbonden door h-bruggen tusen de strengen

[image]

Eiwit Domeinen

• Er zijn ongeveer 200 bekend
• 30-400 residuen per domein
• Eiwitten met verschillende ruimtelijke structuur bevatten soms toch dezelfde domeinen

Eiwitvouwing

• Eiwitten beginnen te vouwen tijdens de synthese
• Trechter model
• Coöperatief, reversiebel, via domeinen en met chaperones
   
• een verkeerd gevouwen eiwit zal ontvouwen m.b.v. een chaperone of zal afgebroken worden door prothease
  
  

1. Chaperone eiwitten binden aan peptideketen om te voorkomen dat deze te vroeg begint te vouwen en te hulpen bij vouwen op latere stadia
2. Soms maken chaperone eiwitten een soort container for de niewe peptideketen om de zorgen dat de omgeving ideaal is.

Assay

• een assay is een procedure om een bepaald stof (eiwit, bijv.) te herkennen

Salting Out

• elk eiwit geeft neerslag bij een bepalde zuotconcentratie
• Zout kan later verwijders worden met dialyse

Dialyse

• Kleine moleculen paseren door de poriën terwijl grote (eiwitten) niet

GPC

• Gel Filtration Chromotografie / Size Exclusion Chromotography
• Sample loopt door een kolom gevuld met polymeer korreltjes.
• Kleine moleculen gaan door de korreltjes en worden vertraagd, grote moleculen stromen sneller door.

Ionwisselaar Chromotografie

• Positief / negatief geladen eiwitten (bij PH 7 ) worden gefiltreerd door genruik van geladen korreltjes. ongeladen moleculen stromen door.
• Carboxylaat - voor positief geladen eiwitten
  Carboxymethylcellulose - voor negatief geladen eiwitten
• Na filtratie kan de eiwit ontbonden worden door de zout concentratie te verhogen.
•  

Affiniteitschromotografie

• Korreltjes met bepaalde verbondel liganden, afhankelijk van het soort eiwit (affiniteit)

HPLC

• High-pressure Liquid Chromtografie
• Hoge resolutie en snllere filtratie door meerdere kolommen en hoge druk 

SDS-PAGE

• Sodium Docecyl Sulfate - PolyAcrylamide Gel Electrophorese
• Gel vertraagt grote moleculen terwijl electrisch veld zorgt voor verplaatsing van moleculen met netto lading
• SDS verstoort bijna alle niet-covalente interacties in eiwitten, en Mercaptoethenol breekt disulfidebruggen em eiwit wordt gekookt tot ontvouwing
• SDS anionen binden om de drie residuen aan de gedenaturaliseerde eiwitten en zorgen voor netto lading inverhouding met lengte peptideketen.
• De bewegelijkheid van eiwitten in de gel is in lineair veband me de log van hun massa

Isoelectric focusing

• De Isolectrische Punt (pI) is de PH waarbij de netto lading van het eiwit wordt null.
• Eiwitten worden gefiltred op de verhouding basische/zure rediduen
• Eiwitten die één netto lading verschil hebben kunnen worden onderscheiden 

Edman Degredation

• Gebruikt om de N-terminal AZ van een peptideketen te ontbined zonder de andere verbindingen te breken.
• Peptiden tot 50 residuen lang kunnen op deze manier worden geanalyseerd.

CNBr

• Cyanogen bromide.
• Splitst polypeptiden alleen aan de carboxyle kant van Methionine (Met) residuen

• Enzyme, knipt peptideketens aan de carboxyle kant van Arginine (Arg) en Lysine (Lys)

Chemotrypsin

• Knipt peptiden aan de carboxyle kant van AZ met aromatische of lang-niet polaire zijketens:  Tyrosine, Tryptophan, Phenylalenine, Leucine en Methionine
• Katalyse gebeurt door een Katalitische Triade

β-Mercaptoethanol

• Wordt gebruikt om disulfide bindingen van peptideketens te breken zodat deze geanalyseerd kunnen worden.

ELISA

• Enzyme-Linked immunosorbent assay
• Een enzym reageert met kleurloze substraat en deze wordt gekleurd.
• De enzym is covalent verbonden aan een antilihcaam, dan wordt de substraat toegevoegd.
• kan hoeveelheden van minder dan een nanogram detecteren

DNA nucleotieden

[image]

[image]

Thymine

Uracil

Adenine

Cytosine

Western Blotting

• Een methode om kleine hoeveelheden eiwit te detecteren door eerst een SDS-PAGE electrophorose uit te voeren, dan de sampel te verplaatsen (blotting) naar een polymeerblad. 
• Een specifieke antilichaam wordt dat toegepast op het blad en vormt een complex met het eiwit.
• Het complex kan dan gedetecteerd worden door het blad met een tweede antilichaam, die de eerste herkend en is radioactief gelabeld. 

Thrombin 

Competitive Inhibitoren

• Substraat en inhibitor allebei aanwezig en concureren over bindingsites van het enzym.
• Km verschuift naar hogere waarde, Vmax blijft gelijk
• De beste competitieve inhibitoren lijken veel op het overgangstoestand van het substraat.
• Km,app=Km(1+[I]/Ki)

Niet-Competitieve Inhibitoren

• Bindt tegelijk met het substaat aan het enzym en zorgt voor conformatieverandering die de werking vanhet enzym remt
• Substraat kan nog steeds binden, maar het percentage actieve enzym is verlaagd.
• Km blijft gelijk, Vmax verlaagd
• Vmax,app=Vmax(1+[I]/Ki)

Covalente Inhibitoren

• Reageren covalent met het enzym, deze wordt dus permanent onactief

Katalytische Triade

• Serine 195, Histidine 57 en Aspartaat 102 vormen samen een Katalytische Triade:
  - De zijketen van Ser 195 vormt een H-brug met de imidizole groep van His 57. De NH van de imidizole groep vormt een H-brug met de carboxilaat-zijgroep van Asp.
• His residue positioneert Ser zijketen en polariseert de hydroxylgroep zodat deze makkelijk deprotoniseerd wordt. Asp residue positioneert de His zijketen en maakt deze een betere acceptor.
   [image]
• De stappen van hydrolyse zijn als volgt:
  
  

1. Substraat bindt
2. nucleofiele aanval van Ser op carboxile c van de AZ
3. tetraëder c laat een H los.
4. Aminegroep van peptide wordt LG en valt weg na een aanval op de extra H bij His
5. Nucleofiele aanval van water op de acyl-enzyme overgangstoestand. 
6.  Tetraëder overgangstoestand valt uit elkaar:
   H2O splitst: één  H bind aan His, OH bindt aan carboxylgroep 
7. Carboxylzuur  komt vrij.

Trypsine

• Trypsine kataliseert hydrolyse van peptidebindingen na een residue met een lange, positief-geladen zijketen: Arginine en Lycine
• Trypsine katalyseert door een katalitische triade
• trypsine selectiviteit is veroorzaakt door een Asp  189 residue die positief-geladen AZ stabiliseert.

Turnover nummer

• van een enzym
• K_cat=V_max/[E]

Membraaneiwitten:

Noem twee soorten en beschrijf hoe deze verankered kunnen zijn aan/in het membraan.

Plymerase Chain Reaction (PCR)

• Ingredienten:
  - Twee primer strengen die aan beide kanten van de gewenste sequentie binden (1 op elk template)
  - Alle deoxyNucleosideTrifosfaten (dNTP's)
  -Een hittebestendig DNA ploymerase
   
• Stappen:
  1) Strengen van Template DNA uit elkaar gehaald door verwarming (95⁰ 15_s)
  2) Afkoelen van oplossing tot 54^o om primers (in overmaat) en templates te laten binden 
  3) Oplossing wordt opnieuw opgewarmd tot 72^o en DNA synthese vindt plaats door Taq DNA Polymerase

Nucleosoom core deetje

• 146 base pairs in de vorm van 2 super-helices omgewikkeld rond een kern van 8 histonen
• meervouwd hiervan vormt de nucleosoomvezel

Chromatine

• Chromatine bestaat uit nucleosomen
• nucleosomen bestaan uit DNA omgewikkeld rond Histonen

Histonen

• Er zijn 4 soorten
• Maken 50% van de chromosoom
• Hebben staarten die veel Lysine en Arginine bevatten, dus positief geladen
• DNA maakt veel contact met de Histonen, voornamelijk door zijn negatief geladen backbone (fosfoesthers) en vouwt tot een linkshandige superhelix om de histonen heen.
• Om het DNA te ontvouwen worden de Lysines in de zijstaarten geacetileert dor enzyme. Dit process wordt gecontroleerd door transcriptiefactoren.

Transcriptie Factore

• Herkennen heel selectief bepaalde DNA sequenties
• Rekruteren andere enzymen (coactivatoren) die Histonen acetyleren, en affiniteit van DNA aan histoon daalt.
• TF moeten vaak geactiveerd worden door Hormonen (bijv. oestrogen)

DNA Helicase

• trekt DNA-strengen uit elkaar voor transcriptie
• verbruikt ATP (hydrolyse)

tRNA

• Transfer RNA
• verbonden aan de C-terminus van een AZ (amino acid attachment site)
• minstens één  soort per AZ
• bevat rond de 75 base pairs

DNA Polymerase

• Synthetiseert DNA m.b.v. twee Mg²⁺ ionen.
• Synthese loopt altijd van 5' naar 3' van DNA
• Een RNA Primer  is nodig, met een vrije 3'einde
• De reactie begint met een nucleofiele aanval van de 3'-OH groep op de binnenste fosfaat van de niewe deoxynucleoside trifosfaat.
• Het enzyme pyrofosfatase  zet de anorganische fosfaat om in orthofosfaat
• De lagging strand kan niet continue gesynthetiseerd wordt en wordt due in stukje gesynthetiseerd van 5' naar 3', met behulpo van primers en DNA ligase, die de gaatjes invult.
• Verbinding wordt gemaakt alleen als nieuwe nucleotiede bij de template strand past. (fout 1x10^-4) 
• Als een fout optreedt, verandert het enzyme conformatie en de verkeerd geplaatst nucleotiede wordt doorgegeven aan het editing site ,  wat de kans op fout tot 1x10^-8 verlaagd.

Ribosomaal RNA

• de voornaamste component van de ribosoom. Er zijn drie soorten (23S,16S,5S) in eukaryoten per ribosoom.

   

Small Nuclear RNA

• doet mee aan splicing van RNA exonen

Micro RNA 

• een klas van kleine (21 nucleotieden ong.) die aan mRNA bindt om de translatie te remmen.

Small Interfering RNA 

• bindt aan mRNA en faciliteert de afbraak ervan.

RNA Plymerase

• Synthetiseert mRNA volgens een Template streng m.b.v. geactiveerde precursors (ATP,GTP,UTP,CTP) en metaalionene (Mg²⁺ of Mn²⁺)
• de 3’-OH van de groeiende keten maakt een nucleofiele aanval aan de binnenste fosfaatatom van de nieuwe nucleoside trifosfaat
• RNA Polymerase kan verkeerd geplakte basen niet weghalen
• Transcriptie begint by Promotor sites:
  - 

  in bactria bij -35 (-35 regio – TTGACA)  en -10 (Pribnow box –            TATAAT) aan de 5’ kant en
  - bij Eukaryoten bij -75 (CAAT box – GGNCAATCT) soms en bij -25 (TATA / Hogness box – TATAAA)  altijd.